304 globulus chalybis Tubingae chemicae elementum immaculatum . SPACA6 structura ectodomaminum continet conservationem superfamilia servorum cum gametarum fusione sociatorum.

Gratias tibi ago pro natura.com adire.Versionem navigatoris limitata CSS auxilio uteris.Ad optimam experientiam commendamus ut navigatro renovato uteris (vel inactivare Compatibilitas Modus in Penitus Rimor).Praeterea, ad sustentationem permanentem, situm sine stylis et JavaScript ostendemus.
Iunctae tres articulos per dictum ostendentes.Utere globulis posterioribus et proximis movere per labitur, vel globulis lapsus moderatoris in fine movere per singulas lapsus.

Standard Specification Of ASTM A240 Type 304 Tube

ASTM A240 304 Coil Tubing ferro

Specifications ASTM A240 / ASME SA240
Crassitudo 0.5mm-100mm
Diameter exterior 10mm, 25.4mm, 38.1mm, 50.8mm, 100mm, 250mm, 300mm, 350mm, etc.
Longitudo 2000mm, 2440mm, 3000mm, 5800mm, 6000mm, etc
Superficies 2B, 2D, BA, NO.1, NO.4, NO.8, 8K, Speculum, tesselatum, caelatum, linea capillorum, flatus arenae, peniculus, etching, etc.
perago Calidum involutum (HR), Frigidum Tube involutum (CR), 2B, 2D, BA NO (8), SATIN (Met cum Plastic Coated)
Forma Tubus rotundus quadratus tubus rectangularis etc.

304 Ruond Tube Compositio et Characteres Mechanicae

Gradus C Mn Si P S Cr Mo Ni N
304 Min.
Maximilianus.
/
0.08
/
2.0
/
0.75
/
0.041
/
0.030
18.00
20.00
/ 8.00
10.50
/
0.10
304L Min.
Maximilianus.
/
0.03
/
2.0
/
1.0
/
0.041
/
0.030
18.00
20.00
/ 9.00
11.00
/
304H Min.
Maximilianus.
0.04
0.10
/
2.0
/
0.75
0.041
/
/
0.030
18.00
20.00
/ 8.00
10.50
/
Gradus Distrahentes fortitudo
(MPa)
Cedat imperium
0.2% Probatur (MPa)
Prolongatio
(% in 50mm)
duritia
Rockwell B
(HR B)
Brinell
(HB)
304 515 205 40 92 201
304L 515 205 40 90 187
304H 515 205 40 92 201

Dimensiones Standard, pondus chart et magnitudo cedulas 304 Tubus inactus

SS 304 Tube Size(mm) SS304 Tube pondus per Unit Area(kg / m)
6*1 0.125
6*1.5 0.168
8*1 0.174
8*1.5 0.243
10*1 0.224
10*1.5 0.318
12*1 0.274
12*1.5 0.392
12*2 0.498
14*1 0.324
14*2 0.093
14*3 0.822
16*2 0.697
16*3 0.971
17*3 1.046
18*1 0.423
18*1.5 0.617
18*2 0.797
18*3 1.121
20*1 0.473
20*2 0.897
20*3 1.27
21*3 1.345
22*2 0.996
22*2.5 1.214

SPACA6 est dapibus sperma superficialis expressa quae critica est ad fusionem gametae per reproductionem mammalium sexualem.Quamvis hoc munus fundamentale, munus specificum SPACA6 perspecta est.cristallum structurae extracellulares dominii SPACA6 elucidamus ad solutionem 2.2 , ostendens duos dapibus compositos ex fasciculo quattuor subductis et Ig-similis β farticulos quasi flexibiles ligatores coniunctos.Haec structura IZUMO1 similis est, aliam gametam fusionis dapibus associatarum, faciens SPACA6 et IZUMO1 membra superfamiliae fecundationis associatorum institutorum, quae hic ut IST superfamilia referuntur.IST superfamilia structura per quattuor helix fasciculo contorto definitur et par CXXC motifs dissolutis connexis.A structura innixa AlphaFold inquisitionis proteome humani identificatur additis interdum membris huius superfamiliae;notabiliter multi ex his servo fusione gametarum implicantur.SPACA6 structura et relatio ad alios IST superfamilias membra absentis nexum praebent in cognitione nostra fusionis gametarum mammalium.
Omnis vita humana incipit a duobus gametis haploide separatis: sperma patris et ovum matris.Haec sperma victor est processus lectionis intensae, in quo decies spermatis cellulae per tractus genitalis feminini transeunt, varia impedimenta superant 1 et capacitatem subeunt, quae eorum motibilitatem et processum superficiei componentis 2,3,4 auget.Etiamsi sperma et oocytes se invicem inveniunt, processum adhuc non est.Oocytes iacuit cumuli cellularum et obice glycoprotein zona pellucida appellata, per quam sperma ad oocytum ingredi debet.Spermatozoa compositione adhaesionis superficiei moleculae et membranae-consociatae et secretae enzymes ad has clausuras finales superandas.Hae moleculae et enzymes praecipue in membrana interiore et acrosomali matricis conditae sunt et deprehenduntur cum spermatis membrana exterior per reactionem acrosomalem percussa est.Ultimus gradus in hoc intenso itinere est eventus spermatis ovi fusio, in quo duae cellulae suas membranas condunt ut unum organismum diploidem efficiat.Quamvis hic processus in reproductione hominum fundamento sit, necessariae interationes hypotheticae male intellectae sunt.
Praeter fecunditatem gametarum chemia fusionis duorum bilabiatorum lipidorum late investigata est.Fusio membranae in genere est processus valde iniquus, qui requirit interdum catalystum ad mutationem structurarum conformationem subeundi, quae duas membranulas inter se densiores efficit, earum continuitatem frangens et fusione8,9 causans.Hae dapibus catalysts fusogens notae sunt et in infinitis systematibus fusione inventa sunt.Requiruntur ad ingressum virales in cellas hospites (eg, gp160 in HIV-1, spica in coronaviros, hemagglutinin in virus influenza) 10,11,12, placental (syncytin) 13,14,15 et gametae fusiones formantes in eukaryotis inferioribus ( HAP2/GCS1 in plantis, protists et arthropodibus) 16,17,18,19.Fusogens pro gametis humanis adhuc inveniendus est, quamvis plures servolus critici ostensae sint pro gametae affectionis et fusionis.Occytus expressus CD9, dapibus transmembranis ad fusionem muris et gametarum humanarum requisitus primus inventus est 21,22,23.Etsi munus praecisum eius obscurum manet, munus in adhaesione, structura adhaesionis foci in ovo microvilli, et/vel rectam localizationem servorum superficiei oocytae probabile videtur 24, 25, 26.Duo dapibus typicis qui critici pro gametarum fusione sunt, sperma dapibus IZUMO127 et interdum oocytes JUNO28 sunt, quorum mutua societas maximus gradus est agnitionis et adhaesionis gametae ante fusionis.Mures masculus Izumo1 knockout et foemina Iunonis tunsae mures omnino steriles sunt, in his exemplaribus spermatis spatium perivitellinum intrant, sed gametae non fuse.Similiter confluentia redacta est cum gametae tractatae sunt cum anti-IZUMO1 vel JUNO27,29 elementorum in experimentis fecundationis humanae in vitro.
Nuper, nuper inventa globus spermatis expressi servo phenotypice similis IZUMO1 et JUNO20,30,31,32,33,34,35 repertus est.Sperma membranae acrosomalis dapibus 6 (SPACA6) notus est essentialis ad fecundationem in magno studio murinae mutagenesis notus est.Insertio transgenii in gene Spaca6 spermatozoam non fusibilem producit, quamquam haec spermatozoa spatium perivitellinum infiltrat 36 .Subsequens studia pulsee in muribus confirmarunt Spaca6 ad gametarum fusionem requiri 30,32.SPACA6 fere solum in testibus exprimitur et formam localizationem similem cum IZUMO1 habet, scilicet intra intimam spermatozoae ante reactionem acrosomalem, et deinde migrat ad regionem aequatorialem post acrosomalem reactionem 30,32.Spaca6 homologi in variis mammalibus et aliis eukaryotis 30 existunt eiusque momenti pro fusione hominum gametarum demonstratum est per inhibitionem fecundationis humanae in vitro resistendo SPACA6 30 .Dissimile IZUMO1 et JUNO, singula structurae, interactiones, functionesque SPACA6 obscura manent.
Ut melius intellegatur processum fundamentalem subesse fusioni spermarum et ovorum humanarum, quae nobis dabunt futuras explicationes in consilio familiari ac tractatione fecunditatis, perduximus SPACA6 structuralia et biochemica studia.Structura crystalli extracellularis dominii SPACA6 fasciculum quattuor helicum (4HB) ostendit et dominium immunoglobulinum-simile (Ig-similis) regionum quasi flexibilium connexum.Ut in praecedentibus studiis praediximus, 7,32,37 structura SPACA6 regio similis est cum IZUMO1 humano, et duo servo- rum inusitatum argumentum communicant: 4HB cum superficie triangularis helicae et par CXXC motifs disulfide connexis.Proponimus IZUMO1 et SPACA6 nunc maiorem structuram affinium servorum superfamiliae coniunctorum cum fusione gametarum definire.Propriis notis utentes ad superfamilias, exquisitam inquisitionem deduxerunt AlphaFold structuralis humani proteome, additis huius superfamiliae membris notis, inter plura membra quae in fusione gametarum et/vel fecundatione implicantur.Nunc apparet commune esse ovile structurae ac superfamiliae servo cum gametae fusione sociatum, et nostra structura praebet tabulam hypotheticam huius magni momenti aspectus mechanismi gametae fusionis humanae.
SPACA6 est dapibus simplicis transmembranis cum uno N glycano coniuncto et sex vincula putativa disiuncta (Figura S1a et S2).Expressimus dominium extracellularem hominum SPACA6 (residuae 27-246) in cellulis Drosphilae S2 et purgavimus interdum utentes nickel affinitate, catione commutationis et magnitudine exclusionis chromatographiae (fig. S1b).SPACA6 ectodomain purificata valde stabilis est et homogenea.Analysis utens magnitudine exclusionis chromatographiae cum lumine polygonali disperso (SEC-MALS) unum apicem revelatum cum pondere hypothetico computato 26.2±0,5 kDa (Fig. S1c).Hoc congruit cum magnitudine ectodomaminum SPACA6 monomericanae, significans oligomerizationem in purificatione non fieri.Praeterea dichroismus circularis (CD) spectroscopia mixtam α/β structuram cum puncto liquefacto detexit 51.3 °C (Fig. S1d, e).Deconvolutio spectris CD revelati 38.6% α-helicalis et 15.8% β elementis subductis (Figura S1d).
SPACA6 ectodomain vitreo usui matricis temere seminis 38 resultans in notitiis cum solutione 2.2 (Tabula 1 et Figura S3).Utens compositione fragmenti substructio substitutionis hypotheticae et phaenomeni phasificationis cum bromide expositionis structurae determinationis (Tabulae 1 et figurae S4), exemplar finale probatum ex residuo consistit 27-246.In tempore structurae definitae nullae structurae experimentales vel AlphaFold in promptu erant.SPACA6 ectodomain mensurae 20 20 85 , constat ex septem helices et novem aba-filatis, et ovile tertiarium elongatum per sex vincula disrumpensum stabilitum habet (Fig. 1a, b).Densitas electronicorum infirma in fine catenae Asn243 partis indicat hoc residuum glycosylation N-coniunctum esse.Constructio constat duabus dominiis: fasciculus helix N-terminus quattuor (4HB) et C-terminalis Ig-similis dominii cum intermedio cardine inter eos (Fig. 1c).
Structura extracellularia dominii SPACA6.Figuram habena extracellularis SPACA6, coloris catenae ab N ad C-terminum e caeruleo ad fuscum rubrum.Cysteines implicatae vinculis disulfide in magenta illustrantur.b Acta extracellularia dominii SPACA6.Eodem colore schematis utere ut in Figura 1a.c SPACA6 extracellulare.Cardo 4HB, cardo et Ig-similis chartae domain habenae coloratae sunt aurantiacae, viridis, et caeruleae, respectively.Lamina non trahuntur ad scalam.
Dominium 4HB SPACA6 helices principales quatuor (helices 1-4) includunt, quae in modum helicis helicis (fig. 2a) dispositae sunt, alternantes inter antiparallel et interationes parallelas (fig. 2b).A parvis additis helicis uni- versis (helix 1′) fasciculo perpendicularis ponitur, triangulum cum helices 1 et 2 formans. Hic triangulus in helico-torto stipatione relative densa helicorum 3 et 4 fasciculo leviter deformata est. Fig. 2a).
4HB N habena terminalis chart.b Summa fasciculi quatuor helices, cujusque helix in tenebris caeruleis ad N-terminum et ad C-terminum atro rubris illustratur.c Tabula rotae Top-down spiralis pro 4HB, unaquaeque residua ut circulus intitulatus cum codice amino amino-unico;tantum quatuor amino acida in summitate rotae numerantur.Residua polaris non-flavescentis colorata, residua polaris danno colorata viridia, residua positivo comminatae sunt caeruleae coloratae, et residua negative oneratae rubrae sunt coloratae.d Facies triangularis 4HB dominii, cum 4HBs in aurantiaco et cardine viridi.Ambae ambae ambages virgulam informes vincula dissolutas ostendunt.
4HB in nucleum hydrophobicum interiorem contrahitur, maxime residua aliphatica et aromatica composita (fig. 2c).Metrum vinculum inter Cys41 et Cys55 disulfitum continet qui helices 1 et 2 simul in triangulo superiore elevato (fig. 2d).Duae additae vincula inter motivum CXXC in Helix 1′ formata sunt, et alterum argumentum CXXC ad extremum aba-hirpini in regione cardinis repertum (Fig. 2d).Argininum residuum conservativum cum functione ignoto (Arg37) intra triangulum concavum ab helice formatum 1′, 1, et 2. Atomorum carbonis Aliphatici Cβ, Cγ, et Cδ Arg37 cum core hydrophobico penitus secant, eiusque guanidines circulos cyclice movent. inter helices 1′ et 1 per interactiones inter Thr32 narum et catenam lateralem (fig. S5a,b).Tyr34 se extendit in cavum relinquens duas cavitates parvas, per quas Arg37 cum solvendo se cohaerere possunt.
Ig-sicut aba-sandwiche ditiones sunt magnae superfamiliae servorum, qui communes duarum vel plurium multi- plicium amphipathicarum aba- plas inter se mutuo se habentibus per nucleum hydrophobicum 39. In C-terminalibus Ig-similis regio SPACA6 eandem formam habet. et constat duobus strata (Fig. S6a).Sheet 1 est β scheda quatuor filorum (sulae D, F, H, I) ubi fila F, H, et constituo dispositionem anti-parallelam, et fila I et D parallela commercio capiunt.Mensa 2 parva est schedae anti-parallelae duplicatae betae subductis (santibus E et G).Vinculum internum disulfide observatum est inter C-terminum catenae E et centrum catenae H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Hoc vinculum disulfidorum analogum est disulfidi vinculi in β-sandwico dominii immunoglobulin40,41.
Quadripartita β scheda cum tota sua longitudine torquet, oras asymmetricas formans quae figura et electrostatica differunt.Ora tenuior est superficies environmentalis hydrophobicae planae quae eminet prae reliquis inaequalibus et electrostatice diversis superficiebus in SPACA6 (Fig. S6b,c).Halo carbonyl/amino narum globuli expositae et enotatum polarium superficiem hydrophobicam ambit (fig. S6c).Margo latior tegitur segmento cappedo helico, quod N-terminalem portionem nuclei hydrophobici impedit et tres hydrogenii vincula cum aperto globo narum F catenae narum (Fig. S6d) format.Pars C-terminalis huius oris magnum sinum format cum nucleo hydrophobico partim exposito.Sinus positivis stipendiis cingitur ob residuos duplices argininis (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 et Arg212-Arg214) et histidine centralis (His220) (Figura S6e).
Cardo regio est segmentum breve inter dominium helicum et dominium Ig-similis, constans ex uno antiparallelo triangulo abastrato (stragula A, B, C), parva 310 helicis, et pluribus segmentis helicis incertis longis.(Fig. S7).Retis covalentis et electrostaticae contactus in regione cardinis stabilire videtur orientationem inter 4HB et quasi domain Ig.Retis in tres partes dividi potest.Prima pars continet duos motivas CXXC (27CXXC30 et CXXXIXCXXC142), quae faciunt vincula inter β hirpinum in cardine et 1′ helix in 4HB.Secunda pars includit interactiones electrostaticas inter Ig-similem dominium et cardinum.Glu132 in cardine pontem salsum apud Arg233 facit in dominio Ig-simili et in cardine Arg135.Tertia pars includit nexum covalentem inter regionem Ig-similem et cardo regionem.Duo vincula dissolvunt (Cys124-Cys147 et Cys128-Cys153) ansam iungunt cardi ligantis, quod stabilitur per interationes electrostaticas inter Gln131 et spartum functionis coetus, aditum ad primum Ig-similis aream praebens.catenae.
Compages SPACA6 ectodomain et singulae structurae 4HB et Ig-like ditiones adhibebantur ut structurae similes quaererent monumenta in interdum databases 42 .Nos aequas identificavimus cum magno Dali Z turpis, parvae deflexionum vexillum, et ustulo LALI magnae (haec residua numero structurae aequivalens).Dum primi 10 hit e plena inquisitione ectodomain (Tabula S1) acceptum Z-score habuit 842, quaesitum solum 4HB vel Ig-similis domain demonstravit pleraque ex his hits tantum β-stitis farti correspondere.ubiquitous ovile in multis proteins.Omnes tres inquisitiones in Dali solum unum exitum reddidit: IZUMO1.
SPACA6 et IZUMO1 similitudines structurae 7,32,37 iam pridem innuuntur.Tametsi ectodomains harum duarum gametarum fusionis associatarum servo tantum 21% seriei identitatis (Figura S8a) communicant, implicatae probationes, inclusa forma vinculi conservata disulfitae et praedicta C-terminalis Ig-similis dominii in SPACA6, licet primo conatu aedificare. homology model of A a SPACA6 mouse using IZUMO1 as a template37.Nostra structura haec vaticinia confirmat et veram similitudinis gradum ostendit.Re quidem vera SPACA6 et IZUMO137,43,44 structurae duae eiusdem architecturae (fig. S8b) communicant cum similibus 4HB et Ig-sicut aba-sandwiche ditionibus a cardine regionis connexis (Fig. S8c).
IZUMO1 et SPACA6 4HB communes differentias habent a fasciculis spiralibus conventionales.Typica 4HBs, sicut ea quae in SNARE interdum complexu in fusione endodomal 45, 46 involvit, helices aequabiliter distantes constantem curvaturam circa axem centralem servaverunt 47. E contra, dominia helica in utroque IZUMO1 et SPACA6 deformata sunt, curvatura variabili et inaequale stipare (Figura S8d).Contortio probabiliter causata ex triangulo helice 1′, 1 et 2, retinetur in IZUMO1 et SPACA6, et confirmata eodem CXXC ARGUMENTUM in helix 1′.Additamentum autem ligamen disulfitum in SPACA6 (Cys41 et Cys55 covalenter connexum helices 1 et 2 supra) creat apicem acutiorem in trianguli apice, SPACA6 magis tortum quam IZUMO1 faciens, triangulis cavi acutioribus.Praeterea IZUMO1 caret Arg37 in centro huius cavitatis in SPACA6 observato.E contra IZUMO1 nucleum hydrophobicum magis typicum residuis aliphaticis et aromaticis habet.
IZUMO1 habet dominium Ig-similis constans ex duplici subductis et quinque aba-plateis subductis.Extra litus in IZUMO1 reponit coilum in SPACA6, quod cum F linea intercedit ut ligamenta hydrogenii narum in acia finiant.Punctum comparationis interesting est praedicta superficies custodia de dominiis Ig-similis duorum servo.Superficies IZUMO1 negative potius quam SPACA6 superficies accusatus est.Additamentum crimen prope C-terminum versus spermatis membranam sita est.In SPACA6 eaedem regiones magis neutrae vel positive obiciebantur (Fig. S8e).Exempli gratia, superficies hydrophobica (oras rariores) et foveas (oras latiores) in SPACA6 negative obicitur et positive obicitur in IZUMO1.
Tametsi relatio et structurae secundariae elementa inter IZUMO1 et SPACA6 bene conservata sunt, structuralis alignatio ditionum Ig-similium ostendit duas dominia in communi orientatione inter se relativa differre (Fig. S9).Fascis IZUMO1 spiralis est curvatus circa aba-Sandwich, figuram supra descriptam "boomerang" faciens circiter 50° ab axe centrali.E contra, trabes helicae in SPACA6 subducta est circiter 10° in oppositum.Differentiae harum orientationum verisimile sunt propter differentias regionis cardinis.In gradu primo sequenti, IZUMO1 et SPACA6 parum sequentiam ad cardinem communicant, exceptis cysteinis, glycinis et acidis asparticis residuo.Quam ob rem vincula hydrogenii et retiacula electrostatica omnino diversa sunt.β schedae secundariae structurae elementa ab IZUMO1 et SPACA6 communia sunt, quamquam vincula in IZUMO1 multo longiora sunt, et 310 helix (helix 5) ad SPACA6 unicum est.Hae differentiae in diversis orientationibus domain eveniunt duos servo secus similes.
Nostrum Dali servo inquisitionis revelatum est SPACA6 et IZUMO1 solas duas structuras experimentaliter determinatas in datorum interdum repositas, quae particularem 4HB ovile habent (Tabula S1).Recentius DeepMind (Alphabet/Google) evolvit AlphaFold, reticulum neurale innixum systematis quod 3D structuras servo e primis sequentiarum 48 accurate praedicere potest.Mox postquam structuram SpaCA6 solvimus, alphaFold database dimissum est, dum praedictae structurae exempla tegunt 98,5% omnium servo in humano proteome48,49.SPACA6 structuram nostram definitam utentes ut exemplar quaerendi, structuralis homologiae quaerendi exemplar in AlphaFold humano proteome candidati identificantur cum possibilibus structuralibus similitudinibus SPACA6 et IZUMO1.Datae incredibilem accurationem AlphaFold in SPACA6 praenuntiando (Fig. S10a) — praesertim 1.1 rms ectodomain comparatam ad structuram definitam (Fig. S10b) — confidimus posse certas condiciones SPACA6 explicatas futuras esse accurate.
Antea, PSI-BLAST quaesitum est botrum IZUMO1 cum tribus aliis servo-consociatis: IZUMO2, IZUMO3, IZUMO450.AlphaFold praedixit has IZUMO plicas familiares in 4HB dominio cum eodem exemplaris vinculi IZUMO1 (Figura 3a et S11) divellere, quamquam Ig-similis ditione carent.Hypothesised IZUMO2 et IZUMO3 esse unum quadratum membranae servo IZUMO1 similes, cum IZUMO4 seclusi esse videntur.Munera IZUMO 2, 3, et 4 servo in fusione gametarum non sunt determinatae.IZUMO3 notum est in acrosome biogenesi partes agere in sperma evolutionis 51 et dapibus IZUMO inventam esse complexam formare.Conservatio servo IZUMO in mammalibus, reptilibus, et amphibiis suggerit functionem suam potentialem consentaneam esse cum aliis servo-familias notis gameto-consociatis, ut DCST1/2, SOF1, et FIMP.
Tabula architecturae domain superfamiliae IST, cum 4HB, cardine, et Ig-simili ditionibus in aurantiaco, viridi, et caeruleo, respective.IZUMO4 unicam regionem C-terminalem nigram spectat.Vincula confirmata et putativa disiluerunt solidis et punctatis lineis respective ostenduntur.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), and TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1). DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) in eodem colore eminus ac tabella monstrantur A. Disulfide vincula in magenta monstrantur.TMEM95, IZUMO2 et IZUMO3 helices transmembranae non ostenduntur.
Dissimilis dapibus IZUMO, alii SPACA servo (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, SPACA9) ab SPACA6 structurae dissimiles esse putantur (Fig. S12).Solus SPACA9 habet 4HB, sed non expectatur eandem orientationem parallelo-anti-paralleli habere, vel idem vinculum disulfidi ac SPACA6.Solum SPACA1 simile dominii Ig-simile habet.AlphaFold praedicat SPACA3, SPACA4 et SPACA5 structuram prorsus aliam habere quam SPACA6.Interestingly, SPACA4 notum est etiam munus in fecundatione agere, sed magis quam SPACA6, sed faciliorem commercium inter sperma et oocyte zona pellucida52.
Nostrae investigationis alphaFold alterum par pro IZUMO1 et SPACA6 4HB, TMEM95 inveni.TMEM95, una sperma transmembrana interdum specifica, mures masculos reddit infecundas ablatas 32,33.Spermatozoa carens TMEM95 morphologiam, motibilitatem et facultatem zonam pellucidam penetrandi et membranam ovi ligandi habuit, at membrana oocyta fuse non potuit.Priora studia docuerunt TMEM95 similitudines structurarum communicare cum IZUMO133.Exemplar enim AlphaFold confirmavit TMEM95 esse 4HB cum eisdem duobus mo- tibus CXXC ac IZUMO1 et SPACA6, idemque addito foedere inter helices 1 et 2 in SPACA6 (Fig. 3a et S11) divellere.Tametsi TMEM95 domain Ig-similis caret, regionem habet cum exemplo vinculi disulfito similis cardo regionum SPACA6 et IZUMO1 (fig. 3b).In tempore publicationis manuscripti huius, server preprint structuram TMEM95 retulit, AlphaFold53 eventum confirmans.TMEM95 SPACA6 et IZUMO1 simillimum est et in amphibiis iam evolutionis conservatur (Fig. 4 et S13).
Inquisitionis PSI-BLASTIS adhibita sunt NCBI SPACA6, IZUMO1-IV, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, et SOF1 databases ad statum harum sequentiarum in ligno vitae determinare.Distantiae inter puncta ramorum scalae non ostenduntur.
Percutiens altiore structurae similitudo inter SPACA6 et IZUMO1 suggerit se condere membra structurae superfamiliae conservatae, quae TMEM95 et IZUMO II, III, et IV continet.notae membra: IZUMO1, SPACA6 et TMEM95.Quia pauca membra tantum possessiones Ig-similis possident, notatio superfamiliae IST est dominii 4HB, quod singulares notas habet omnibus his servo- ribus communes: 1) Coiled 4HB cum helice in anti-parallelis/parallelis alternatione disposita (Fig. 5a), 2) Fasciculus faciem triangularem habet constans ex duobus helices intra fasciculum et tertium helix verticalis (Fig. clavem aream (Fig. 5c.) ARGUMENTUM CXXC, in thioredoxino quasi servo repertum, functioni notum est. ut sensorem redox 54, 55, 56, motivum in IST familiares coniungi possunt cum interdum disulfide isomerases sicut ERp57 in fusione gametarum.
Membra superfamiliae IST definiuntur tribus notis notis dominii 4HB: quattuor helices alternae inter orientationem parallelam et antiparallelam, fasciculum helicum ba triangularem facies, et ca CXXC motio duplex inter moleculas parvas formata.N helixes terminales (orange) et cardo regionis β-hirpin (viridis).
Similitudine posita inter SPACA6 et IZUMO1, probata est facultas prioris ligandi IZUMO1 vel JUNONIS.Interferometria Biolayer (BLI) est methodo ligandi in motu fundata, quae antea commercium inter IZUMO1 et IUNONEM quantitare solebat.Post incubationem biotin-intitulatum sensorem cum IZUMO1 ut esca cum magna intentione analytici JUNO, signum validum deprehensum est (fig. S14a), indicans ligaturam inductam mutationem in crassitudine biomaterialis apice sensori adnexo.Similia signa (ie, JUNO sensori ut esca contra IZUMO1 analytum copulata) (Fig. S14b).Nullum signum deprehensum est cum SPACA6 adhibita est analytica contra sensorem IZUMO1 vel sensorem-tentum JUNO (Figura S14a,b).Huius signi absentia indicat extracellulare spatium SPACA6 non penitus cum extracellulari regione IZUMO1 vel IUNNO.
Quia BLI tentamentum fundatur in biotinylatione liberae lysinae residua in esca interdum, haec modificatio impedire ligare potest si residua lysina in commercio implicantur.Praeterea orientatio ligaminis relativi ad sensorem impedimenta sterica creare potest, ideo tentationes conventionales viverra-down factae sunt etiam in recombinante SPACA6, IZUMO1 et JUNO ectodomains.Quamvis hoc, SPACA6 cum IZUMO1 vel JUNO (Fig. S14c,d) nullum commercium congruere cum experimentis BLI observatis, praecipitavit.Secundum positivum imperium, commercium Iunonis cum IZUMO1 eius intitulatum confirmavimus (Figura S14e et S15).
Quamvis structurae similitudo inter SPACA6 et IZUMO1, inhabilitas SPACA6 ligandi IUNO mirum non est.Superficies humanae IZUMO1 plus quam 20 residua habet quae cum JUNO inter se occurrunt, etiam resi- siones e singulis trium regionum (quamvis pleraeque in regione cardinis sita sunt) (Fig. S14f).Harum residua una tantum conservatur in SPACA6 (Glu70).Cum plures residui substitutiones pristinas proprietates biochemicae retinuerunt, essentiales residuum Arg160 in IZUMO1 substitutum est per negationem Asp148 in SPACA6 accusatus;priora studia docuerunt Arg160Glu mutationem in IZUMO1 ligationem ad JUNO43 fere penitus abolere.Differentia praeterea in regione orientationis inter IZUMO1 et SPACA6 insigniter auxit aream superficiei locorum aequipollens in SPACA6 (Fig. S14g).
Quamvis nota necessitas SPACA6 pro gametae fusionis et eius similitudinis cum IZUMO1, SPACA6 aequivalens JUNO munus obligandi habere non videtur.Ideo notitias structurales nostras coniungere conati sumus cum argumentis momenti, quae per biologiam evolutionis evolutionis sunt.Sequentia alignment de SPACA6 homologorum conservationem structurae communis ultra mammalia ostendit.Exempli gratia, cysteine ​​reliquiae etiam in amphibiis distantibus adsunt (fig. 6a).ConSurf servo utens, multiplex series datae noctis retentionis ex 66 sequentiarum ad superficiem SPACA6 sunt deformatae.Hoc genus analyseos ostendere potest quae residua in evolutione interdum conservata sunt, et indicare potest quae regiones superficiei munere funguntur.
a Sequentia alignment de SPACA6 ectodomains ex 12 diversis speciebus confectis utens OMEGA CLUSTAL.Secundum analysim Consurf, positiones maxime conservativae in caeruleo notantur.Residua Cysteine ​​rubro illustratur.Termini domain et secundae structurae elementa in capite noctis ostenduntur, ubi sagittae β fila et fluctus helices indicant.The NCBI Access Identifiers containing the sequences are: human (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), simia capuchinus (Cebus mimicus, XP_017359366), equus (Equus caballus, XP_023506102), orca (Orcinus orca3_034).ovis (Ovis aries, XP_014955560), elephantus (Loxodonta africana, XP_010585293), canis (Canis lupus familyis, XP_025277208), mus (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian diabolus (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), Platypus, 8) 61_89 et Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).In humano ordine numeratio fundatur.b Superficies repraesentatio SPACA6 structurae cum 4HB in summitate et Ig-simili regione in fundo, colores in aestimatione conservationis a ConSurf servo fundatur.Partes optimae conservatae caeruleae sunt, partes modice conservatae in albo, minimae vero in flavo.purpureum cysteinum.Tres inaequaliter superficies altam protectionis gradum demonstrantes monstrantur in insulis intitulatis resarciendis 1, 2 et 3. A 4HB viverra in dextra parte (idem color schematis) ostenditur.
SPACA6 structura tres regiones superficiei valde conservatas habet (fig. 6b).Patch 1 palmorum 4HB et cardo regionis et continet duos pontes conservatos CXXC disiuncta, retis ARG233-Glu132-Arg135-Ser144 cardinis (fig. S7), et tres residua aromatica externa conservata (Phe31, Tyr73, Phe137).latiore limbum (fig. S6e), quod plures residua in sperma superficiei positive obicitur.Interestingly, haec panni rudis epitopam anticorpi continet quae antea ostensa est impedire cum SPACA6 30 functioni.Regio III palmos in cardine et uno latere Ig-similis dominio est;Haec regio continet prolines conservatas (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) et residuas externas contra polarem/praeceptas.Mire, pleraeque residua super 4HB superficie valde variabiles sunt (Fig. 6b), quamvis ovile homologum (per conservatismum nuclei fasciculi hydrophobici) et ultra IST superfamilia, conservatur.
Quamquam haec regio minima in SPACA6 cum elementis structurae secundae detectae paucissimae sunt, multae reliquiae cardinis regionis (inclusa regione 3) valde conservantur inter homologos SPACA6, quod indicare potest orientationem fasciculi helici et β-sandwici partes agere.ut optimatium.Nihilominus, quamvis ampla hydrogenii compages et reticulorum electrostaticarum in cardo regione SPACA6 et IZUMO1, evidentia flexibilitatis intrinsecae videri potest in alignment multiplicium structurarum permissarum IZUMO137, 43,44.Nox singularum ditionum bene incidit, sed orientatio ditionum inter se relativa ab 50° ad 70° ab axe centrali (Fig. S16).Ad dynamicas SPACA6 in solutione intelligendas, experimenta SAXS fiebant (Fig. S17a,b).Ab initio restauratio SPACA6 ectodomain structurae cristallinae virgae conformata (fig. S18), quamquam insidias Kratky aliquantum flexibilitatis ostendit (fig. S17b).Haec conformatio cum IZUMO1 discrepat, in qua dapibus solutus figuram boomerang sumit tam in cancello quam in solution43.
Ad specificationem regionis flexibilis, hydrogen-deuterii spectroscopii massae commutationis (H-DXMS) in SPACA6 fiebat et cum notitia antea in IZUMO143 comparata (Fig. 7a,b).SPACA6 magis flexibilior est quam IZUMO1, ut patet ex superiori deuterii permutatione per structuram post 100.000 permutationis.In utraque structura, pars C-terminalis regionis cardinis altam commutationem ostendit, quae probabiliter admittit rotationem 4HB et Ig-similiter circumscriptam inter se relativam.Interestingly, pars C-terminalis cardinis SPACA6, reliquiis 147CDLPLDCP154 constans, est regio 3 valde conservata (fig. 6b), fortasse indicans flexibilitatem interdomain esse plumam SPACA6 evolutionis conservatam.Secundum analysin flexibilitatem, CD thermae tabellinae datae ostenderunt SPACA6 (Tm = 51.2°C) minus stabilis esse quam IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fig. S1e et S19).
a H-DXMS imagines SPACA6 et b IZUMO1.Recipis deuterium commutationis tempore indicato determinatum est.Gradus hydrogenii deuterii commutationis colore indicantur in scala gradiente ex caeruleo (10%) ad rubeum (90%).Nigrae scriniorum areas altae commutationem repraesentant.Termini 4HB, cardo et Ig-similis dominii in structura crystalli observata supra primariam seriem ostenduntur.Deuterii gradus commutationis in 10 s, 1000 s, et 100,000 s machinati sunt in chartula superimposita in superficiebus hypotheticis pellucidis SPACA6 et IZUMO1.Partes structurarum cum gradu deuterii commutationis infra L% albae coloratae sunt.Areae supra 50% H-DXMS commutatio in scala gradiente colorantur.
Usus CRISPR/Cas9 et muris geneticae technicae geneticae strategies ad identitatem plurium factorum magni momenti pro sperma et ovi ligatione et fusione perduxit.Praeter structuram IZUMO1-JUNO et CD9 bene notatam commercium, plerique e proteins cum fusione gametarum sociati structurae et officiatorie aenigmaticae manent.Characterisationis biophysicae et structuralis SPACA6 est alia particula adhaesionis/fusionis hypotheticae aenigmatici in fecundatione.
SPACA6 aliaque membra superfamiliae IST in mammalibus valde conservata apparent necnon in singulis avibus, reptilibus, et amphibiis;re vera, SPACA6 etiam ad fecundationem in zebrafish requiruntur 59. Distributio haec est similis aliis fusionis notis notis servo-consociatis sicut DCST134, DCST234, FIMP31, et SOF132, suggerens has factores esse HAP2 deficientes (etiam notae GCS1) servo qui catalyticae actionis multorum protistarum responsales sunt.plantae atque arthropoda.Fusio fecundata proteins 60, 61. Quamvis valida structurae similitudo inter SPACA6 et IZUMO1, genesis modum translitterandi vel horum servorum in sterilitate murium masculinorum consecuta est, significans functiones suas in fusione gametarum non duplicari..Latius, nemo notarum spermatis servo requisitus ad tempus fusionis redundat adhaesionem.
Restat quaestio aperta an SPACA6 (alii superfamiliae IST) coniunctiones intergameticas participent, retiacula intragametica formant ut magnas proteins ad puncta fusionis conscribat, an fortasse etiam fusogens fallaces agunt.Studia Co-immunopraecipitationis in cellulis HEK293T commercium plenae longitudinis IZUMO1 et SPACA632 revelarunt.Nostrae tamen ectodomains recombinantes in vitro non se occurrunt, suggerentes interationes in Noda et al visas.utraque in constructio deleta (nota caudae cytoplasmicae IZUMO1, quae ad fertilizationem necessariam esse demonstratum est).Vel, IZUMO1 et/vel SPACA6 ambitus obligandi specificas requirere possunt, quas in vitro non exprimimus, sicut physiologice conformationes specificae vel complexiones hypotheticae, quae aliae servo (notae vel nondum inventae) continentur.Etsi IZUMO1 ectodomain creditur mediare affixum spermatozoae ovi in ​​spatio perivitellino, propositum SPACA6 ectodomain lateat.
Structura SPACA6 varias superficies conservatas indicat quae in interactionibus interdum-interationes possunt interesse.Pars regionis cardinis conservata proxime adiacentem ARGUMENTUM CXXC supra ( Patch 1 designatum ) plures residuas aromaticas externas habet , quae saepe cum hydrophobicis et π-positis interactiones inter biomoleculas coniungunt.Lata latera dominii Ig-similis (regionis 2) positive rimam faciunt cum residuo valde conservato Arg, et elementorum contra hanc regionem antea 30 fusione gametarum angustos adhibita sunt.Anticorpus agnoscit epitopam linearem 212RIRPAQLTHRGTFS225, quae tres habet ex sex arginine residuis et His220 valde conservatis.Non liquet utrum praesentatio ob residuas speciales residua vel totius regionis obveniat.Locus huius hiatus prope C-terminum β-sandwich indicat commercium cum spermatis vicinis servo, non autem cum servo oocyte.Praeterea retentio tanguli prolini-divitis valde flexilis intra 3 cardinum situm esse potest interdum commercii interdum-vel potius retentio flexibilitatis inter duas regiones.Genus magni momenti est ad munus SPACA6 ignotum.fusionem gametarum.
SPACA6 proprietates adhaesionis intercellularis habet servo, incluso Ig-sicut aba paniculi farti.Multi servolus tenaces (exempli gratia cadherini, integri, adhaesiones, et IZUMO1) unam vel plures possessiones aba-fandorum arearum habent, quae servo e membrana cellae extendunt ad scuta eorum ambitus 63,64,65.Ig-similis regio SPACA6 argumentum etiam in aba farti adhaesionis et cohaesionis vulgo repertum continet: duplicata linearum parallelarum in extremis aba paniculorum, quae clamps mechanica nota sunt.Creditur hanc causam resistentiam augere ad tondendas copias, quae valet pro proteins quae in interactiones intercellulares implicantur.Nihilominus, quamvis haec similitudo cum adhesinibus, nunc nullum argumentum est SPACA6 cum albumine ovorum inter se cohaerere.SPACA6 ectodomain ad JUNO ligare nequeat, et cellulas SPACA6 exprimens HEK293T, hic de quibus hic ostenditur, cum oocytis vix penitus carentibus zona 32 .Si SPACA6 vincula intergametica constituat, hae interationes postulare possunt modificationes post-translationales vel ab aliis spermatis servo stabiliri.Ad posteriorem hypothesin IZUMO1 deficientem spermatozoam ligant oocytes, demonstrans moleculas praeter IZUMO1 in adhaesione gametae gradus 27 implicari.
Multi virales, cellulares et fusionis progressus servo proprietates habent, quae munus suum fusogens praedicunt.Exempli gratia: fusione viralis glycoproteinae (classes I, II et III) hydrophobicam fusionem peptidis vel fasciam habent in fine interdum in membrana hospitis inserenda.Tabula hydrophilicitatis IZUMO143 et structura (determinata et praedicta) IST superfamiliae nullam apparentem fusionem peptidis hydrophobici ostendit.Ita si qui servo in IST munere superfamiliae fusogens, id faciunt modo ab aliis exemplis notis differentem.
Denique, functiones membrorum IST superfamiliae servorum cum gametarum fusione sociatorum manent mysterium tantalizationis.Nostrae SPACA6 propriae moleculae recombinante et eius resoluta structura perspicientiam praebebit in relationibus inter has structuras communes eorumque munus in gametarum affectione et fusione.
Sequentia DNA correspondens ectodomain humano SPACA6 praedictae (NCBI accessio numeri NP_001303901.1; residua 27-246) fuit codon-optimizata ad expressionem in cellulis melanogastris Drosophilae S2 et summatim ut fragmentum gene cum sequenti descriptam Kozak (Eurofins Genomic)., signum secretionis BiP et 5′ et 3′ correspondentes terminantur ad ligationem-independentem huius gene in elocutione vectoris pMT fundatam in promotoris metallothionein modificatam ad electionem cum puromycin (pMT-puro).PMT-puro vector encodes thrombin synthesis locum quem sequitur 10x-His C-terminalis tag (Figura S2).
Transfectio stabilis vectoris SPACA6 pMT-puro in D. melanogaster S2 (Gibco) fiebat similiter in protocollo usus pro IZUMO1 et JUNO43.S2 cellae dilapsae et auctae sunt in medio Schneider (Gibco) suppletae cum retentione finali 10% (v/v) caloris inactivated vitulum foetum serum (Gibco) et 1X antimycoticum antibioticum (Gibco).Cellae primae (3.0 x 106 cellae) patellae in singulis puteis 6-lamellarum bene (Corning).Post 24 horas incubationis 27°C, cellulae cum mixtura 2 mg SPACA6 pMT-puro vectoris et effectionis transfectionis gerentis (Qiagen) translatae sunt secundum protocollum corporis.Cellulae translatae per 72 horas incubabantur et deinde cum 6 mg/ml puromycinum metiebantur.Cellulae tunc ab instrumento Schneider perfecto separatae erant et in serum libero mediae Insect-XPRESS (Lonza) ad productionem dapibus magnas positae sunt.A 1 L massa culturae cellae S2 crevit usque ad 8-10 × 106 ml-1 cellulae in 2 L ventilatas lagona polypropylene plana carinis Erlenmeyer et postea sterilis cum concentu finali 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) et eliquata sterilia.adduci.Culturae inductae incubabantur 27° C. ad 120 rpm per quatriduum.
Medium conditionatum continens SPACA6 a centrifugatione ad 5660×g in 4°C remotum, sequitur systema filtrationis tangentialis centramata (Pall Corp) cum membrana 10 kDa MWCO.Medium contractum applica, continens SPACA6 ad 2 ml Ni-NTA agarosum resinae (Qiagen) columnae.Resina Ni-NTA lota est cum 10 voluminibus columnae (CV) quiddam A et deinde 1 CV quiddam A addita est ad imidazolam finalem L mM concentratio addita.SPACA6 elusa est cum 10 ml quiddam A cum imidazole suppletum ad ultimam intentionem 500 mM.Restrictio classis thrombin (Milliporis Sigma) dialysin tubingorum (MWCO 12-14 kDa directe addita) ad 1 unitatem per mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 et 150 mM NaCl (buffer B) pro dialysi.) ad 4°C pro 48 horis.SPACA6 thrombin-adglutinatum tunc dilutum triplex erat reducendi intentionem salis et onerata in 1 ml MonoS 5/50 GL catio commutationis columnae (Cytiva/GE) aequilibratae cum 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Catio commutatoris lota est cum 3 CV of 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, deinde SPACA6 elusa est gradatione lineari ipsius 0 ad 500 mM NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 pro 25 CV.Post ion commutatio chromatographiae, SPACA6 ad 1 ml contracta erat et isocratice eluctabatur ab ENrich SEC650 10 x 300 columna (BioRad) aequilibrata quiddam B. Secundum chromatogrammum, piscinam et fractiones intentos SPACA6 continens.Puritas a coomassie maculata electrophoresis regebatur in 16% gel SDS-polyacrylamidei.Dapibus concentratio quanta per absorbance ad 280 um per legem Beer-Lamberti et ad extinctionem molarem theoricam coefficientis fuit.
SPACA6 purgatum dialysum pernoctare contra 10 mM sodium phosphatem, pH 7.4 et 150 mM NaF et ad 0.16 mg/mL ante analysim per spectroscopium CD dilutum est.Spectrale intuens CDs cum necem 185 ad 260 um collecta in a Jasco J-1500 spectropolarimetro utens vicus cuvettes cum 1 mm longitudinis optica (Helma) ad 25°C ad 50 nm/min.Imagines CD baseline corrigebantur, averaged per X acquisitiones, et ad ellipticitatem residualem (θMRE) in gradibus cm2/dmol convertebantur;
ubi MW est pondus hypotheticum cujusvis specimen in Da;N amino acida numerus est;θ est elliptica in millidegreis;d respondet longitudini viae opticae in cm;dapibus concentration in unitates.

 


Post tempus: Mar-01-2023