310 10*1mm Immaculata chalybea tubinge chemicae componentis plexa, Ditiones N-terminales in hydrogelorum spidroin formant in fibrillis amyloidibus innituntur et suggestum interdum immobilizationis praebent.

Gratias tibi ago pro natura.com adire.Versionem navigatoris limitata CSS auxilio uteris.Ad optimam experientiam commendamus ut navigatro renovato uteris (vel inactivare Compatibilitas Modus in Penitus Rimor).Praeterea, ad sustentationem permanentem, situm sine stylis et JavaScript ostendemus.
Iunctae tres articulos per dictum ostendentes.Utere globulis posterioribus et proximis movere per labitur, vel globulis lapsus moderatoris in fine movere per singulas lapsus.

Specification

310 10*1mm

Compositio chemica

Mechanica Properties

Recombinantes araneae retiacula serica (inhibitiones araneae serici) multas habent applicationes potentiales in progressione novarum biomateriarum, sed natura eorum multimoda et aggregatio-prona faciliores reddit ad obtinendum et ad usum faciles.Hic referimus servo recombinante miniaturam spidroin et praesertim ipsam aream N-terminalem (NT) velociter formare hydrogelos pellucidulosi sui et pelluciduli ad 37 °C.fusionis proteins constans ex NT dapibus et viridibus fluorescentibus vel phosphorylasi nucleosidis purinis formantibus fusionis proteins plene functionis.Hydrogels.Proventus nostri ostendunt recombinationem NT et fusionem servo praebere altam expressionem cedere ac hydrogelos cum proprietatibus attractivis ut diaphane, gelatio sine transcursu, ac immobilizationem directam in alta densitate servo activorum.
Araneae totidem quot glandularum sericarum variae septem, quae singulae speciem sericum efficiunt.Omnes septem species sericae compositae sunt ex servo serico (spidroins) residua circiter 6000 longa et amplam continent regionem repetitam centralem circumdatam ditionibus sphaericis N- et C-terminalibus (NT et CT) 1,2.Genus late pervestigatum sericum, ampulla primaria, producitur a glandula ampulla primaria.In hac glandula monolayer cellularum epithelialium servo spidroin componit et eas in lumen glandulae secretat, ubi in solubili forma (doping) ad concentrationes maxime altas (30-50% w/v)3,4.Ordinatio et conformatio praecipuorum servolorum in glandula ampullaris spidroin agitata sunt, sed experimenta plurima indicat praesentiam generaliter helicae et/vel temere helicae conformationis et structurae micellares vel lamellares 5,6,7,8,9,10.Cum dominia repetita regulant proprietates mechanicas fibrarum sericarum, β schedam nanocrystal et structuras amorphos 11,12,13,14,15 formantes, fibrae sericae componunt, respondentibus condicionibus mutandis secundum glandulam sericum 16, 17,18.Sericum formationem moderando, 19. Dominia terminalia evolutionis conservantur et earum munus commune esse potest omnibus servo spidroin 2, 20,21.Per transitum per glandulam, pH spidroin ab circa 7.6 ad <5,716 decrescit et cum tonderet, et motu mediante per ductum sensim angustatum augetur.In solutione, CT est parallela constitutiva α-helical dimer17, sed respondet humilibus pH et tondendis viribus, CT evolvit ac permutat β-strata 16, 17, fortasse excitat β laminis in repetita regiones Converte 16. NT monomericae sub. conditiones in lumine glandulae reflectentes et solutionem spidroin mediante, sed in reducta pH, protonatio plurium acidi carboxylici enotatum ducit ad dimerizationem NT cum pKa proxime 6.5, inde NT stabiliens et spidroin in magna figens. quantitates.networks16,18.Ita, NT praecipuum munus in formatione filamentis agit, mutato a monomer in litura ad dimer in fibre23,24,25.NT valde solutum et helicum manet sub omnibus condicionibus studuit ad diem 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, quae evolutionem suam inspiravit tamquam solubilitatem-accommodandi pittacium ad productionem servo heterologorum.
Recombinante mini aranea interdum serica, ex una NT, regione una brevi repetita, una CT, et his6 tag (His-NT2RepCT) ad purificationem, tam solutum est in quiddam aqueum, quam interdum araneae serici indigenae et mimi indigenae notae magni momenti aranei serici. .coverage 25.31.RepCT eius-NT2RepCT in fibras continuas trahi potest utens machina biomimetica in qua pH 8 efficiens solutum in aquae lavacrum pH 525,32,33,34,35 extruditur.Bioreactor fermentationis E. coli exprimens eius-NT2RepCT et subsequens post curationem in >14 g/L cedere post purificationem.Summus cedunt, altae solubilitas, et adaequata responsio condicionum eius-NT2RepCT ad acidicas conditiones attributae sunt omnes NT23, XXV, XXXIV.
Hic referimus celeri formationem hydrogelorum diaphanorum e servo recombinante spidroin, excepto NT solo, solutionem interdum incubando in 37 °C.Usus thioflavin T fluorescens (ThT), Fourieriani spectroscopiam infrarubrum (FTIR), nuclei resonantiae magneticae spectroscopiae (NMR) et microscopii transmissionis electronici (TEM), invenimus NT et microspidera in bracteas et fibrillas amyloideas transformationes structurarum pati. cum nes formantur.Praeterea fusiones proteinorum ex NT et dapibus viridium fluorescentium (GFP) vel phosphorylasi nucleosidi purini (PNP) hydrogelorum cum fragmentis fusionis plene functis.Summus throughput expressio in exercitibus heterologis, cum celeri formatione hydrogelorum sub condicione physiologica copulata, facultatem aperit productionis cost-effectivae hydrogelorum cum functionibus machinatis.
Dissimile plerisque recombinantibus spidroin proteins36, Eius-NT2RepCT in Tris-HCl quiddam stabile in pH 8 et usque ad 500 mg/mL sine praecipitatione colligi potest.Ideo mirati sumus quod haec interdum celerius formas optically manifestas, hydrogelos sui sustinentes, cum 37°C incubatis (Fig. 1b-d).Praeterea studia demonstraverunt Suum-NT2RepCT gelationem in amplis concentrationis dapibus (10-300 mg/mL) factam esse et hanc intentionem cum temporis gelatione inverse connecti (fig. 1c et accessiones Fig. 1).Ad inveniendum quas partes hydrogel-NT2RepCT mediae formationis eius exploravimus, singulas regiones singulas et varias compositiones perscrutavimus utentem vas inversionis tentare (Figura 1a, b).Omnes probatae fractiones spidroin recombinantis gelatorum formatorum (in interdum concentratio 300 mg/mL) minus quam 1 h, excepta 2Rep praecipitata (Fig. 1b).Hoc innuit NT et CT solum in compositione, vel cum iteratione coniungi posse in 37°C gelasse, et Tagum His6 non attingere hunc processum aliquatenus significantem.Communi notione dato NT esse interdum valde solutum ac stabile, et praecedentes relationes hydrogelorum recombinantis spidroin gelationi effectus gelationi tribuisse, mutatis conformationalibus in regionibus repetitis et/vel CTs, NT se posse.Gelatio inopinata fuit inventio.Adiecta tabula 1) 37, 38, 39. Mire, NT iam colligationem intra 10 minutas concentratio ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Experimenta inversio ampullae cum variis concentratione NT perceptis, quae ad >50 mg/mL solutionem NT citius colligitur quam Ipsius-NT2RepCT ad intentionem respondentem (w/v, Figura 1c).
Schematica repraesentatio spidroin variarum constructorum in hoc opere studuit.b Gel tempus ad 37 °C pro variis servo recombinantibus (300 mg/mL) verificatur invertendo phialam.CT gel statim sine incubatione (<300 mg/mL), 2Rep praecipitat (300 mg/mL, scalae 5 mm).c Gel tempus Suo-NT2RepCT et NT ad concentrationes interdum indicatas 37°C.d Photographemata eius-NT2RepCT et NT hydrogelorum cum araneo et littera "NT" infra impressis (sive 200 mg/mL, scalis 5 mm).
Hydrogels a variis recombinantibus proteinis spidroin formatus colores leviter diversos habet, et oculus nudus notationes varias diaphaneitatis gradus ostendit (fig. 1b).nes nt aliae nes opacae fiunt egregie liquet.His-NT2RepCT&NT nes conjecerunt in tubos cylindricos a forma integra removeri posse (fig. 1d).
Ad probandum an aranea serica tunicarum naturalium gel sub conditionibus nunc inventae causa gelationis de servo recombinante spidroin, tunicarum coactae sunt ex ampla ampulla glandulae araneae pontis Swedish (Larinioides sclopetarius).Vestimenta in 20 mM Tris-HCl repositae sunt quiddam in 50 mg/mL (subnixum pondere sicco mensurato), sed nulla gelatio observata est die 21 incubationis tempore 37°C (Figura 2a suppletiva).
Ad huiusmodi nes quantitare, mensurae rheologicae adhiberi possunt ad processum gelationis investigandum et altiores proprietates mechanicas determinandas.Speciatim vigilantia ad modulum (elasticitatis) temperaturarum elevatarum informationes de gelingis temperie necnon viscoelasticis proprietatibus vestitionis praebere potest.Temperatus experimenta oriuntur (utendo 1°C/min sub 25-45°C, innixa in studiis solutionum stirpis serici naturalis utens) 40,41 ostendit modulos repositiones ipsius NT2RepCT et NT solutiones augeri cum temperatura augendo.aucta (fig. 2 et adiecta fig. 3).Egregie, NT modulus ad temperaturam inferiorem cum suo-NT2RepCT crescentem incepit, consentaneum gel temporis velocius observatum, cum NT immediate incubatum erat cum suo-NT2RepCT ad 37°C (Figura 1).Post sequentem guttam in temperie, modulus repositionis ad bona inferiora non rediit et supra modulum detrimentum manebat (vide Fig. 3. Accessiones), indicans gelationem stabiliam scelerisque irreversibilem.Post gelationem, modulus finalis elasticus ab 15 ad 330 kPa pro hydrogelo suo NT2RepCT per collationem 100-500 mg/mL, et modulus elasticus finalis pro hydrogelo NT (100-500 mg/mL) ab 2 ad 1400 distincti. kPa (Fig. , 2 and agger data) see Supplementary Fig. 3).
Mutatio in temperatura in mensuris Sui-NT2RepCT (300 mg/mL) et b NT (300 mg/mL) cum concussione.Sagittae indicant trend temperatura, et levius colorum notitiae moduli repositae depingit tentantes valores torques inferiores pro instrumento quam a fabrica specificati, quae causa est sonitus augendi.c Finis moduli accumulatio-NT2RepCT&NT post temperatura elevata (100, 300 et 500 mg/mL).Omnes moduli lectiones ad frequentiam 0.1 Hz sumuntur.
Ut methodus potentialis ad investigandas mutationes conformationales cum gelatione coniungendas, spectra FTIR ipsius-NT2RepCT et NT ante et post gelationem in 37°C (Figura 3a, b) commemoravimus.Ut expectatur, spectra eius-NT2RepCT et NT solutiones correspondebant proteins ostendens structuram α-helix/randam coil secundariam, cum cohorte pronuntiata 1645 cm-1.Utraque enim hydrogelia, gelatio in formatione duorum brachii in medio I band circiter 1617 cm-1 et 1695 cm-1 consecuta est (fig. 3a, b), formationem antiparallelarum aba-sagittarum demonstrans.Hae mutationes etiam in respectivo secundo derivativo et differentia spectris gelationi clare perspici possunt (Supplementary Fig. 4b).Duae fasciae NT aba-stratorum acutiores erant quam eius-NT2RepCT, significans totum contentum globulorum aba-orum in hydrogeli NT2RepCT altiorem esse quam hydrogeli.
a FTIR effusio spectris sui-NT2RepCT et b NT (utriusque 500 mg/mL) ante (solutio) et post incubationem 37°C.c TEM imagines resuspendae 50 mg/ml NT2RepCT nes et d NT.Scala bar 200 um.e Fibra diametri hydrogelorum HIS-NT2RepCT&NT.n = 100 fibrillae mensuratae, p < 0.0001.In errore vectes deviationis vexillum monstrant.Centrum erroris est medium.Incomparabilis t-test (duo cercopitheci) pro analysi statistica adhibita est.f Fluorescens variarum servo recombinante spidroin (100 mg/mL) ad 37 °C sine concussione.g NT (100 mg/mL) experimenta inoculationis ex 100 mg/mL NT gel cum 0%, 5%, 10%, et 20% seminibus.
Analysis gel utens microscopio tradendo electronico (TEM) ostendit hydrogel ex fibrillis amyloideo-similis (fig. 3c, 3d).fibrillae NT-formatae erant elongatae (5-12 nm in diametro) ramulae, dum fibrillae eius-NT2RepCT longitudinis breviores et signanter diametro latiores (7-16 um) (Fig. 3e).Hi eventus nobis permiserunt sequi de motu fibrosis utentes thioflavin T (ThT) primordium.Pro omnibus recombinantibus proteins spidroin, signum fluorescentium auctum est, cum exemplaria in 37 °C incubata sunt (Fig. 3f, Accessiones Fig. 5a).Cum hac inventione, microscopica examinis NT et His-NT2RepCT sub gelling conditionibus uniformem incrementum in ThT fluorescens sine notabili loci congerie aggregatorum ThT-positivorum notabilis revelavit (Fig. 5b, c).Formatio fibrillarum ThT-positivarum non comitatur aucto turbido NT et HIS-NTCT (Fig. 5d), quod significat retis fibrillarum in gel formare sine claritate gel.Semen fibrillarum preformatorum parvas addendo quantitates fibrillarum aliquarum amyloidarum 42, 43,44 signanter accelerare potest, sed addendo 5%, 10% vel 20% (w/w) NT ad solutionem hydrocoagulantium NT.seminis effectus (Fig. 3g).Fortasse hoc accidit ex eo quod fibrillae in hydrogela relative fixae sunt nec ut semina adhiberi possunt.
Inopinatum mores servo recombinantis spidroin ad altas temperaturas excitaverunt adhuc spectroscopiae nuclei resonantiae magneticae (NMR) studia ad cognoscendas mutationes conformationis cum formatione gel associatarum.NMR spectra solutionum eius-NT2RepCT per tempus descripta solutiones 37°C demonstravit CT partim complicatum fuisse, cum NT et 2Rep signa evanuerunt (Fig. 4a), significans maxime NT et 2Rep formationem His- moderatam partialiter moderatam. NT2RepCT hydrogel.Signum CT etiam ad 20% pristinum intensionem attenuatum fuit, suggerens CT maxime fixum et incorporatum esse in structuram hydrogelii.Nam minor portio CT, quae tam mobilis est quam in praeincubato specimen et solutione NMR observata, spectra carent significationibus pro residuo primo 10 exstructo, fortasse ob difficilem immobilizationem portionis appositae Ipsius-NT2Rep.Spectra NMR -Statuum hydrogelorum -NT2RepCT praedominantem praesentiam α-helices et β laminis patefecit et, ad minus, coil conformationem temere (Fig. 4b).Transpositio chemica analysis methioninae residua tantum in NT exhibens ostendit hanc aream ad β schedae structuram esse conversam.Tempus dependens spectra NT in solutione ostendit decrementum uniforme in signo intensio (Fig. 4c), et solidus NMR ipsius NT hydrogelorum demonstravit pleraque residua NT ad structuras β schedae convertendas esse (Fig. 4d).Conformatio 2Rep separatim determinari potuit propter suam inclinationem ad aggregatum.Nihilominus, status solidus NMR spectris NTCT et Ipsius NT2RepCT hydrogelorum simillima spectavit (Fig. 4b; Fig. 6b), suggerens 2Rep parum conferre ad partem structuralem hydrogel-His-NT2RepCT.Pro CT hydrogeli, α-helices, β-schedae, et temere helicae structurae secundariae inventae sunt (Supplementary Fig. 6d).Hoc suggerit nonnullas partes CT manere α-helices, aliae aba-schedae fieri.Ita eventus spectroscopii NMR suadeant NT magni momenti esse ad hydrogel formationem ac etiam in β-schedae conformationem in fusione cum 2Rep et CT transformare.Cum hoc consentaneum, nuper invenimus zipperos spatiales amyloideas in omnibus quinque helices ditionis NT probabile formare, et Waltz algorithmum amyloidogenicum in helix 1 regione praedixisse (fig. 4e).
2D spectris 15N-HSQC 10 mg/mL Solu- tio eius NT2RepCT ante (hyacintho) et 19 horarum incubationis (rubrum) ad 37°C.Singulae crucis apices in spectro rubro et F24, G136, polyA in spectro caeruleo singulis litteris amino acidi symbolis et numeris reliquiis notantur.Insets dependentiam signi intensio temporis pro residua selectarum ex ditionibus NT, 2Rep, CT CT monstrant.b spectra solidae radiofrequentiae (RFDR) hydrogelorum suorum-NT2RepCT.Correlationes reliquiarum Cα/Cβ in spectris RFDR observatae statutae sunt ex comparatione cum exemplaribus chemicis tralationes et valores ex statisticis82,83 deductis et eorum secundariis structurae.SSB - sideband rotating.c spectra dimensiva 15N-HSQC 10 mg/mL NT solutio in incubatione ad 37 °C pro 36 horis.Insese volumetric intensionem versus temporis ostendit.d Spectra solida RFDR spectra NT hydrogelorum.Correlationes reliquiarum Cα/Cβ earumque structurae secundariae in spectris RFDR observatae indicantur.e Fundatur in NT45.79 fibrillationis propensio profile e datorum Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta vis spatii trabeae fulguris in fenestra hexapeptidis in kcal/mol ostenditur.Serae rubrae hexapeptides significant cum fibrosis alta propensione (Rosetta energia infra -23 kcal/mol; infra linea punctata).Vectes viridis fragmenta cum Rosetta energia supra limen indicant et ideo minus probabile est zippers stericos formare.Fragmenta proline continentur ab analysi exclusa (sine columnis).Quadrata areae amyloidosis praedictae a Waltz algorithm81 indicant (https://waltz.switchlab.org).Sequentia aminore acidorum residua NT in summo est, et species residua in structura β secundario (per spectroscopium solido-NMR determinatum) rubro monstrantur.Positiones quinque NT α-helices ut (H1-H5)28 designantur.
Ad pH <6.5, HT dimerizes, resistens calori vel ureae inductae denaturation18.Ad elucidandum quomodo NT dimerizationem et stabilitatem gelationem afficiunt, solutiones 100 mg/ml NT continentes moderatae sunt in pH 8, 7, et 6 test inversionis phialae utentes.NT exemplaria in pH 8 et 7 gelled post 30 min in 37°C incubata, sed pH 8 gel clara manserunt, dum pH 7 gel praecipitatum visibile praebuit (Fig. 5a).E contra solutio continens HT in pH 6 gel non formabat, et magna praecipitatio videri potuit post 20 min sub 37°C.Hoc innuit se dimersos et/vel earum stabilitatem altiorem cum monomersis comparatam impedire gelationem.Formatio praecipitis pro NT in pH 7 et 6 non expectata est, cum relatum sit NT solutum esse ad 200 mg/ml27, facile post denaturationem caloris replicatur, et etiam α-helix in valoribus inferioribus retinet. pH 18. Probabilis harum discrepantiarum explicatio est, quod antea experimenta relata sunt in cella temperatura vel infra, vel in relative depressione interdum concentratione 16,18,19.
NT inversion phialae test (100 mg/mL) ad pH 8, 7, 6 et 154 mM NaCl (pH 8) post incubationem ad 37°C.b NT spectra CD cum et sine 154 mM NaF et 154 mM NaCl, respectively.Ellipticitas molaris in 222 um convertitur ad proportionem plicarum naturalium.c NT inversiones tentationes (100 mg/mL) NT* (37 °C et 60°C), NTA72R (37°C), et ejus-NT-L6 (37 °C et 60°C).d CD spectra NT mutants NT*, NTA72R, et NT-L6.Ellipticitas molaris in 222 um convertitur ad proportionem plicarum naturalium.e Inversionis experimentum NTFlSp, NTMiSp et NTMiSp redactum (100 mg/mL).Squamae bar- 5 mm.f CD spectra NT, NTFlSp, NTMiSp et redacta NTMiSp.Ellipticitas molaris in 222 um convertitur ad proportionem plicarum naturalium.Plena NT spectra sub 25 °C et 95 °C ostenduntur in Figura additamenti VIII.
Concentratio physiologica salis determinat interactiones electrostaticas inter NT subunitas et dimerizationem NT translationis ad pH 18 inferiorem.Praesentiam 154 mM NaCl et NaF invenimus gelationem quidem inhibere, respective (Fig. 5a, b; accessiones Fig. 2b) et hos sales stabilitatem monomerorum NT monomerorum augere (fig. 5b, accessiones Fig. 8). .Etiam confirmat stabilitas amplificationem, quam dimerizationem, formationem gel impedire.
Ut ulteriores partes dimerizationis et stabilitatis in gelatione interdum exploremus, duobus mutantibus usi sumus, NT* et NTA72R, qui etiam monomericae apud humilem pH28.30.NT* est duplex crimen inversitatis mutant in quo apparentis dipolaris crimen distributio monomeris complanatur, quod prohibet dimerizationem et prorationem stabilitatem monomericam auget.NTA72R dipole accusatus est, sed Ala-restituta Arg-ala in termino dimerso sita est, ergo mutationes inter se interationes subunit interationes ad dimerizationem requisitae.In incubatione 37°C, NT* hydrogelum formabat, cum NTA72R gel opacum pro 15 min formaret (Fig. 5c).Cum tam NT* et NTA72R non possunt dimeriri, sed in monomerorum stabilitate differre (Fig. 5d), hi eventus valde suadent altam stabilitatem thermodynamicam prohibere NT gelling.Hoc quoque confirmatur eo quod HT* gel format cum instabilis est ad caliditatem caliditatem (post 8 min ad 60°C; Fig. 5c).Antea ostensum est altum contentum methioninae in NT plicatili naturali liquescere et quod sex Met ad Leu substituit (hic ut His-NT-L6 refertur) fortiter stabilire monomer NT46.Ex suppositione structurae flexibilitatem requiri ad formationem gel electronicam, invenimus stabilitatem eius NT-L6 mutant non gel in 37 °C (Figura 5c, d).Nihilominus, His-NT-L6 etiam gel formavit in incubatione 60° pro 60 min (Fig. 5c).
Facultas NT transformandi in hydrogelos structuras et formas β-schedulae quibusdam applicare videtur, sed non omnes e domiciliis NT spidroin.NTS e diversis generibus serici et speciebus aranearum, Trichonephila clavipes (NTFlSp), nes formatae non obstante contenta methionina relative humilis et alta stabilitas thermarum (Fig. 5e, f et Tabula Accessiones 2).E contra, NT e interdum spidroin parvis ampullaribus ex Araneo ventricoso (NTMiSp) cum stabilitate scelerisque humili et alta contenta methionina hydrogelos non formavit (Supplentary Table 2 and Fig. 5e, f).Hi sociari possunt cum praesentia intramolecular vincula disuelli 29,47.Congruenter, cum vincula NTMiSp divulsa fuissent, hydrogel post incubationem 37°C pro 10 min formavit (Fig. 5e).Demum notandum est flexibilitatem structurae magni momenti esse, non autem sola norma formationis gel ex NT.Alius factor, qui fortasse pertinet, propensio est ad fibrillas amyloideas formandas, et analysis cum datorum zipper et Waltz algorithmus ostendit correlationem inter facultatem nes formandi et regiones amyloidogenicas praesentiam, necnon amplitudinem regionum praedictarum. steric zippers formare.Correlatio facta est (Tabula 2 Supplementaria et accessiones fig. 9).
Facultas NT ad fibrillas formandas et nes sub conditionibus secundis ad hypothesandum nos perduxit, NT fusiones cum fragmentis dapibus aliis adhuc nes cum plena functione fusionis socii formare possunt.Ad hoc probandum, dapibus viridis fluorescentibus (GFP) et phosphorylase purino nucleoside (PNP) ad C-terminum NT, respective adduximus.Proventus fusionis proteins in E. coli expressae cum altissimis redditibus finalibus (150 mg/L et 256 mg/L culturas lagenas quassas pro culturas Suo-NT-GFP et HIS-NT-PNP respective) congruentes cum illis quae ostensa sunt. nam alii proteini ad NT Ref.30. Fusio servo-NT-GFP (300mg/mL) et Ipsius NT-PNP (100mg/mL) fusio servo- rum formatorum post 2 horas et 6.5 horarum 37°C, immo fractio GFP immutata manebat.servatur post gelationem, cum 70% intensio fluorescentiae initialis manente post gelationem (Fig. 6a).Ut PNP activitatem in his-NT-PNP solutionibus et nes metiri debeamus, confusionem interdum cum NT diluere debebamus, quia actio enzymatica puri praeparationis erat extra detectionem extensionis tentationis ad concentrationes colligendas.Gel formatur mixtura continens 0.01 mg/mL His-NT-PNP et 100 mg/mL NT retenta 65% activitatis enzymaticae initialis exemplorum praeincubatorum (fig. 6b).Gel in mensura integer mansit (Supplent. Fig. 10).
fluorescens intensio relativa ante et post gelationem sui NT-GFP (300 mg/mL) et phialam inversam continens hydrogelum (300 mg/mL) sub lumine visibili et UV.Puncta singulae mensuras (n = 3) monstrant, vectes erroris vexillum declinationis ostendunt.Mediocris valor in centro erroris vectes ostenditur.b PNP activitas consecuta est analysi fluorometrica utendi solutionibus et nis constans ex NT (100 mg/ml) et mixtura continens 0.01 mg/ml his-NT-PNP et 100 mg/ml dollariorum Novae Taiwan.Fundum ostendit phialam inversam continentem hydrogeli continens eius-NT-PNP (5 mm talearum).
Hic referimus formationem hydrogelorum ex NT et aliis servo spidroin recombinante incubando solutionem interdum 37°C (Figura 1).Ostendimus gelationem sociari cum transformatione α-helices in β-stratos et formationem fibrillarum amyloidearum similium (fig. 3 et 4).Haec inventio mirum est quomodo NTs globulosi fasciculos quinque helix plexos notos ob solubilitatem altissimam ac firmitatem in concentratione >200 mg/mL ad 4°C per aliquot dies XXVII.Praeterea, NTs post denaturationem caloris in µM concentrationibus interdum infimis facile explicantur.Formatio fibrilla secundum nostros eventus complexionem requirit >10 mg/mL interdum retrahitur ac temperatura leviter elevata (Fig. 1).Hoc consentaneum est cum idea quod fibrillae amyloideae formare possunt ex servo globoso plicato, qui in statu ex parte explicato ob ambigua thermarum sub conditionibus physiologicis 48 .Exempla de servo qui hanc conversionem sustinent includunt insulinum 49, 50, β2-microglobulinum, transthyretinum et lysozymum 51, 52,53.Quamvis NT sit α-helix in statu suo nativo, circiter 65% catenae polypeptidis compatitur cum formatione stericae zipper (Fig. 4e) 45 .Cum monomerus dynamice mobilis46 est, has regiones amyloidogenicas potentiales in temperaturis modice elevatis et in concentrationes totalium dapibus, criticam intentionem amyloideae fibrillae formationis attingere potest.Hanc rationem sequentes, relativum negativum inter intentionem spidroin et gelationem temporis (Fig. 1c) invenimus, et si conformatio monomeric NT stabilitur vel per mutationes (NT*, His-NT-L6) vel addito sale, impedire potest. formatio hydrogelorum (fig. 5).
Pleraque fibrillae amyloideae a solutione praecipitatae evanescunt, sed sub certis condicionibus hydrogels 55, 56,57 formare possunt.Hydrogel-formantis fibrillae typice altam rationem habent et retiacula tria dimensiva stabilia formant per implicationem hypotheticam, 55,58 congruentes cum eventibus nostris.Pro formatione hydrogel in vitro, proteins saepe plene vel ex parte explicantur, exempli gratia, detectio ad solvendas organicas, caliditas (70-90°C) et / vel pH humilis (1.5-3.0) 59, 60, 61,62.Spidroin hydrogelorum hic descriptorum duram processus non requirunt, nec agentia transversalis ligaturae ad hydrogelos stabiliendos requirunt.
Antea relatum est spidroin repetere et QDs, quae β-secta permutationis in lana serica subire videntur, hydrogelos formant.Inventionibus nostris comparati, incubationis tempora et/or incubationis temperaturae significanter longiores vel superiores erant, respective, et inde hydrogeli saepe opaci erant (Figura 7 et Tabula Accessiones 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 69. Praeter velocitatem gel tempora, NT hydrogeli >300 mg/mL (30%), omnibus aliis descriptis hydrogelis dapibus serici serici recombinantibus descriptis, ac hydrogelis naturalibus sicut gelatina, alginata (2%), agaro (0.5% ) et collagen.(0.6%) (Figura 7 et Tabulae Accessiones 1 et 3) 37,39, 66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Gel tempus et modulus elasticorum hydrogelorum in hoc studio comparati sunt cum aliis hydrogelis spidroin fundatis et hydrogelis naturalibus selectis.Notae datae sunt cum conditiones geographicae descriptionis.APS Aconitum persulfate, locus temperatus.Data XXXVII, XXXVIII, XXXIX, LXIV, LXV, LXVI, LXVII, LXVIII, LXIX, LXX, LXXI, LXXII, LXXIII, LXXIV.
Araneae vias elaborasse videntur, ne spidroin a gelingo durante reponantur.Quamvis magna interdum in glandula serica coniunctis, magna repetitio regionis cum dominio terminali coniungitur significat apparentem intentionem NT et CT in glandula proxime 10-20 mg/ml correspondere, in fine huius studii.requisiti in vitro formationis hydrogelis observatae.Praeterea similes collectiones salium 16 stabilitae NT, ut in glandulis sericis (fig. 5b).NT conformatio pervestigata est in E. coli cytosol et arctius complicata quam in vitro examinata inventa est, praeterea indicans salem vel alios factores in vivo aggregationem impedire.Attamen facultas NTs transformandi in fibrillas β-sectatas magni momenti esse potest ad filamenta formationis et in futuris studiis investigari debet.
Praeter novas aspectus institutionis NT-amyloidalis-fibrilli et hydrogeli in hoc studio observatas, etiam ostendimus hoc phaenomenon habere posse applicationes biotechnologicas et biomedicas (Fig. 8).In probatione conceptus, NT cum GFP vel PNP combinavimus, et ostendimus fusionem interdum hydrogelorum etiam incubatis 37 °C formare, et fractiones GFP et PNP, post gelationem (Fig. 6).Phosphorylases nucleosides magni momenti sunt catalystae synthesis analogorum nucleosiderum75, quae nostram inventionem ad industriam biopharmaceuticam pertinentes reddit.Notio exprimendi fusionem servo, qui hydrogelos pellucidos formare sub aequis conditionibus permittit, creationem hydrogelorum officiatorum cum secundis proprietatibus in amplis applicationibus sicut enzyme immobilizationis, medicamentorum remissionis et texti machinalis moderati.Praeterea, NT et NT* signatores efficientes sunt 30, quod significat NT et eius variantes adhiberi posse ad productionem solutionis solutionis solutionis et subsequentis creationis scopo immobilitatis servo in 3D hydrogelorum.
NT solutum est, α-helicum et stabile sub concentrationibus (µM) et 37°C.In eadem temperatura, sed in concentratione crescente (>10 mg/ml), nes formae NT fibrillis amyloideo-similes constantes sunt.Fusio NT proteins etiam nes fibrillares cum fragmentis fusionis plene functionis formant, permittens varios servos in 3D hydrogelis utentes NT immobilitari.Bottom: NT (PDB: 4FBS) et illustrationes reticulorum fibrarum et structurarum interdum adnexarum (amissae et non in scalam ductae, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Constructa (vide Tabulam additamentum 4 pro indice completo incluso sequentium amino acidorum) in plasmido pT7 claudebantur et in E. coli BL21 (DE3).E. coli plasmidarum machinatorum continens inoculata in Luria sorbitione, cum kanamycin (70 mg/l) suppleta et pernoctare in 30°C et 250 rpm crevit.Cultura tunc inoculata est 1/100 in LB medium kanamycin continens et excultum in 30°C et 110 rpm usque ad OD600 pervenit 0.8.Pro studiis NMR, bacteria in medio minimali M9 creverunt, continens 2 g 13C D-glucosi (Aldrich) et 1 g Ammoni chloridi 15N (Cambridge Isotope Laboratorium, Inc.) pro interdum labella cum isotopes.Temperatura ad 20 gradus Celsium demitte et interdum expressionem inducunt cum 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (concentratio finalis).Post expressionem interdum pernoctare, cellulae 7278g, 4°C pro 20 min.Cellulae globulos 20 mM Tris-HCl, pH 8, resuspensae sunt, et congelata usque ad usum ulteriorem.Cellulae dilapsae sunt cinematographicae disruptoris (TS series machinarum series, Systems Constant Systems limitatum, Anglia) ad 30 kPa.Tum Lysates centuplo 25 000 g per 30 minuta ad 4°C fuerunt.Pro NTMiSp, globulo in 2 M urea resuscitatus est, 20 mM Tris-HCl, pH 8, et sonicatus est pro 2 min (2 s/, 65%), dein iterum centrifugae ad 25,000 xg, 4° C. intus 30 min.Supernatans in columna Ni-NTA oneratus erat, lotis 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazolis, pH 8, ac tandem dapibus eluebatur 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Ad generandum NT2RepCT et NTCT, thrombin digestio inducit situm (ThrCleav) inter ipsius et NT.Thrombin synthesis sites sunt etiam in HIS-NT-ThrCleav-2Rep (producit 2Rep), Ejus thioredoxin-ThrCleav-NT (producit NT), Thioredoxin-ThrCleav-CT (producit CT), Ejus Thioredoxin-ThrCleav-NT. .* (producit NT*), suum Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (producit NTA72R), suum Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (producit NTF1Sp), et Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (producit NTMiSp).Constructa cum thrombin digesta (1:1000) et dialyda pernoctare in 4° C. cum 20 mM Tris-HCl, pH 8, utens membrana dialysis spectra/Por cum molecularium pondere limen 6-8 kDa.Post dialysin, solutio in columnam Ni-NTA onusta est et effluxus in quo dapibus usurae continentur, colligitur.Concentrationes interdum determinatae sunt metendo absorbance UV 280 nm utendo exstinctione coefficientium singulorum interdum, exceptis NTF1Sp, quibus Bradford tentamentum protocollo fabricatoris usus est.Puritas a SDS polyacrylamide constituta (4-20%) gel electrophoresis et Coomassie caeruleae egregie maculat.Dapibus coactae sunt utentes centrifugium columellarum (VivaSpin 20, GE Curis) ad 4000 xg cum 10 kDa pondus hypotheticum in 20 minutis cyclis interclusi.
Solu- tio dapibus et diligenter pipet 150 µl in 1 ml septum phialae perspicuum (8 x 40 mm Thermo Scientific).Fistulae pillei erant et obsignatae parafilmo ad evaporationem impediendam.Exempla (n = 3) incubata sunt 37°C vel 60°C, invertuntur periodice ad gelationem servandam.Exemplaria quae non gel incubabant saltem una septimana.Diminuere NTMiSp dissolvere vincula cum 10 mM DTT per 10 µM interdum.Ad enucleationem gelationem aranearum sericum tunicarum naturalium, pons Swedish araneae incisus, duae glandulae principales ampullatae positae sunt in 200 μl 20 mM Tris-HCl quiddam pH 8 et incisum ut litura a glandulis separare permittat..Glandularum contenta in quiddam dissolvuntur, 50 µl ad determinandum pondus siccum (per incubationem phialarum apertarum ad 60°C pondus constantem) et 150 µl ad gelationem ad 37°C.
Mensuratio geometriae/instrumentum est ferro immaculato utens laminam parallelam cum summo diametro 20 mm et intervallo 0,5 mm.Calefacere specimen ab 25 °C ad 45 °C et ad 25 °C ad rate of 1 °C per minute utens laminam puram ferro fundo Peltier.Mensurae vibrationes fiebant frequentia 0.1 Hz et in regione viscoelasticae lineari materiae ad contentionem 5% et 0.5% ad exempla 100 mg/mL et 300-500 mg/mL, respective.Consuetudo humiditatis cubiculi uti ne evaporatio fiat.Data per Prismam 9 resolvitur.
Pro colligendis spectris infrarubentibus (IR) spectris cella temperies ab 800 ad 3900 cm-1.ATR fabrica, sicut levis via per spectrometrum, ante et per experimentum aerem saccatum siccis purgatur.Solutiones (500 mg/mL ad absorptionem cacumina in spectris aqua obscuratis) in crystallis fistulata sunt, et nes (500 mg/mL) formatae sunt ante mensurae et deinde ad crystalla translata (n = 3).1000 lustra scripti sunt cum solutione 2 cm-1 et cycli nullius officii 2. Secunda derivativa computata est OPUS (Bruker) utens amplitudine novem punctorum.Spectra ad eandem regionem integrationem inter 1720 et 1580 cm-1 normalizatae sunt utens F. Menges "Spectragryph - Spectroscopia Optica Software".In spectroscopio ATR-IR, penetratio profunditatis trabi ultrarubri in exemplum est numerorum dependens, inde magis effusio ad fluctus inferiores quam ad superiores fluctus numerorum.Haec effectus correcta non sunt pro spectris in Fig.3 quia valde parva sunt.Spectra correcta huius figurae computata sunt programmate Bruker OPUS utentes.
In principio, quantitas comprehensiva conformationis dapibus fieri potest post certa deconvolutione partium in medio inter I apicem.Sed in praxi aliqua impedimenta oriuntur.Sonus in spectro sicut cacumina (falsa) apparent in deconvolutione.Praeterea, cacumen ob aquarum flexionem coincidit cum positione amid I cacuminis et similem magnitudinem habere potest ad exempla quae magnam vim aquae continentem, ut gel aqueus hic studuit.Ideo inter I apicem penitus non conauimus corrumpere, et observationes nostrae tantum considerari debent pro aliis modis, sicut NMR spectroscopia.
Solutiones 50 mg/ml NT et ipsius NT2 RepCT colligebantur pernoctare in 37°C.Tum hydrogel dilutum cum 20 mM Tris-HCl (pH 8) ad concentratio 12.5 mg/ml bene agitata et piperata ad gel frangendum.Deinceps hydrogel dilutus est 10 temporibus cum 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 µl exempli aenei craticulae cum formvaris applicata est, et excessus specimen cum charta deletione remotum est.Exempla bis abluta sunt cum 5 µl aquae MilliQ et maculatae 1% uranyl formatae per 5 minutas.Detrahere maculam bibulas chartas, tum aerem sicca reticulum.Imaginatio in his gridis fiebat utens FEI Tecnai 12 Spiritus BioTWIN operans ad 100 kV.Imagines expositae sunt ad x 26,500 et x 43,000 magnificationes utentes in camera Veleta 2k 2k CCD (Olympus Mollis Imaging Solutiones, GmbH, Münster, Germania).Pro singulis specimen (n = 1), imagines 10-15 scripti sunt.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) adhibita est analysis imaginis et mensurae fibrarum diametri (n = 100, fibrarum diversarum).Prisma 9 adhibitum est ad probationes imparatas (duo haliaeetus).Medium His-NT2RepCT et NT fibrillae erant 11.43 (SD 2.035) et 7.67 (SD 1.389) um, respective.Fiducia intervallum (95%) est -4.246 ad -3.275.gradus libertatis = 198, p < 0.0001.
80 µl liquidorum speciminum continens 10 µM thioflavinum T (ThT) in triplicato mensuratum (n = 3) sub conditionibus statis utentes aduncturam 96-atrum puteum fundum laminis fundum perspicuum (Corning Glass 3881, USA).Fluorescentiae differentiae scriptae sunt utens 440 colum um excitationis et colum 480 um emissionem (FLUOStar Galaxy e BMG Labtech, Offenburg, Germania).Signum THT neque saturatum neque exstinctum est, quod experimenta cum diversis concentratione THT fiebant sine signo intensio mutato.Record absorbance in 360 um pro obducto mensurae.Ad experimenta seminis, 100 mg/mL nes ad 37° C. formatae sunt, resuspendendae et adhibitae sunt ad rationes molares 5%, 10%, et 20% seminis.Data per Prismam 9 resolvitur.
Stipes thaw eius-NT2RepCT et NT >100 mg/mL in glacie et sparguntur per 0.22 µm sparguntur.Concentrationes computatae sunt per absorbancem mensurando 280 um Nanodrop utendo.In puteis laminae bene nigrae non ligantis (Corning) cum liquido fundo, exemplaria diluta sunt ad 20 mg/ml in 20 mM Tris-HCl pH 8 et mixta cum 5 µM ThT (contentio finalis), concentratio summa specimen L µl volumen.Exemplaria singulis 10 momentis ante 37 °C in microscopio CellObservo (Zeiss) microscopio cum transmisso canali lumine et excitatione FITC excitandi et emissiones emissiones imaginandi ThT ponit.A 20x/0.4 lens ad imaginationem adhibetur.Rhoncus caeruleus (Zeiss) et ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ad imaginem analysin adhibiti sunt.Praeparatae etiam sunt Cels solutiones ex NT et His-NT2RepCT ad collationem 50 mg/mL continens 20 mM Tris pH 8 et 5 µM ThT et incubatis 37°C pro 90 min.Partes gel translatae sunt ad novum puteum continens 20 mM Tris, pH 8, et 5 µM ThT in nigra non ligatione 96 bene bracteae fundo perspicuae.Acquirere fluorescentiam viridis et lucida campi imagines ad 20x/0.4 magnificationem.ImageJ ad imaginem analysis adhibitum est.
Solutio spectra NMR consecuta 310 K in 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometro instructa cum QCI Resonantia Quadrupole Campo Cryoprobe Pulso Gradiente (HFCN).NMR exemplaria continens 10 mg/mL dapibus homogeneum cum 13C, 15N intitulatum, dissolutum in 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Mutationes chemicae NT2RepCT in pH 6.7 ad apicem 23 in spectro 2D 15N-HSQC assignare solebant.
Magia angulus spectra solidi NMR NMR (MAS) spectris 13C, 15N-intitulatis hydrogelis scripti sunt in spectrometro Bruker Avance III HD in 800 MHz cum 3.2 mm 13C/15N{1H} specillo electronico instructi.Sample temperatura moderata usus gasi amnis temperatus variabili in 277 K. Resonantiae rotationale duae dimensiva dipole (DARR)76 et reiunctio radiophonica (RFDR)77 spectra acquisita sunt frequentiis MAS 12.5 kHz et 20 kHz, respectively.Crux polarizationis (CP) ab 1H ad 13C fiebat utens aggere lineari ab 60.0 ad 48.0 kHz ad 1H, 61.3/71.6 kHz ad 13C (ad 12.5/20 kHz MAS) et contactus temporis 0.5–1 ms.Spinal6478 decocatio ad 73.5 kHz adhibita est in notitia collectionis.Tempus acquisitionis erat 10 millium secundorum et cyclus morae erat 2.5 secundis.Unius Cα/Cβ correlationes in spectris RFDR observatae assignatae sunt secundum notas residuas in chemicis tralationes et multiplices correlationes in spectris DARR connexis.
In datorum Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) aestimandis propensionibus volitantibus et Rosetta energia pro NT, NTFlSp et NTMiSp adhibita est.In database Zipper Rosetta Energy80 computat, quae plures munera industriae gratuitae ad exemplar et structuram dapibus resolvens componit.Impiger planities -23 kcal/mol vel inferioris indicat altam inclinationem fibrillatam.Vis inferior maiorem stabilitatem duorum β-forum in forma zipper significat.Praeterea Waltz algorithmus usus est ad regiones amyloidogenicas praedicendas in NT, NTFlSp et NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Solutio dapibus NT mixta cum 2-(N-morpholino) acido ethanesulfonico (MES) quiddam in pH 5.5 et 6.0 ad pH ad pH 6 et 7, respective admixtum est.Concentratio dapibus finalis 100 mg/ml erat.
Mensurae fiebant in spectrometro J-1500 CD (JASCO, USA) utendo 300 μL cuvette cum via optica 0,1 cm.Dapibus ad 10 μM dilutum est (n = 1) in quiddam phosphatis 20 mM (pH 8).Dapibus stabilitatem resolvere in praesentia salis, proteins in eadem intentione (n=1) evolvit, in quiddam phosphatis 20 mM (pH 8) continens 154 mM NaF vel NaCl, respective.Scans caloris ad 222 n ab 25°C ad 95°C descripti sunt cum rate calefactione 1°C/min.Proportio servo sativa inclusa computata est formula (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal).Praeterea quinque spectra pro singulis specimen ab 260 um ad 190 nm ad 25°C conscripta et post calefactum ad 95°C.Quinque spectra averaged, trita et ad ellipticitatem molarem convertebantur.Data per Prismam 9 resolvitur.
Fluorescens intensio Ipsius-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) in triplicata (n = 3) mensuratum est in 96-bene cornibus catillis cum fundo pellucido nigro (Vretro 3881, USA) sub condicionibus stativis.Specimina mensura cum fluorescenti-substructio laminae lectoris cum excitatione adsum 395 um et emissionem recordare 509 um ante gelationem et 2 horarum ad 37°C.Data cum Prismate IX resolvitur.
Ornamentum nucleosidum phosphorylasis purinae activitatis primordium (modum fluorometrica, Sigma Aldrich) secundum instructiones fabricae adhibita est.Ut metiaris activitatem in nes et solutiones continentes Suum NT-PNP, commisceas 10 jectum sui-NT-PNP cum 100 mg/mL NT ad summam voluminis 2 µL, quia gel signum dedit supra deprehensionem intervallum statuti.Imperium ad nes et solutiones sine His-NT-PNP adsciti sunt.Mensurae bis factae sunt (n = 2).Postquam actio mensurata est, reactionem mixturam removit et photographatae gel photographatae sunt ut gel integrum maneret in mensura.Data per Prismam 9 resolvitur.
Pro magis notitia de studio consilio, naturam abstractam ad hoc articulum connexum videre.
Figurae 1 et 2 exhibentur notitia initialis.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, 6 ficus accessiones.3, adiecta fig.5a, d, adiecta fig.6 et adiecta fig.8. Data ab hoc studio in Zenodo datorum https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Notitia NMR in hoc studio datae sunt in promptuario BMRBig sub introitu ID bmrbig36.Structurae GFP & PNP desumptae sunt ex PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Resurgens, A. et Johansson, J. adstare aranea serici artificialis.Nationali Chemical.biologia.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes genome diversitatem genesis aranearum serici et earum complexum exprimit.National Genette.49, 895–903 (2017).